Nature子刊:英属哥伦比亚大学揭示植物塑造根际微生物组新机制

FERONIA通过调节活性氧来限制根际微生物组中的假单胞菌

FERONIA restricts Pseudomonas in the rhizosphere microbiome via regulation of reactive oxygen species

Nature plants [IF:13.256]

DOI:https://doi.org/10.1038/s41477-021-00914-0

发表日期:2021-05-10

第一作者:Yi Song(宋毅)1,2

通讯作者:Cara H. Haney (cara.haney@msl.ubc.ca)1,2

合作作者: Andrew J. Wilson, Xue-Cheng Zhang, David Thoms, Reza Sohrabi, Siyu Song, Quentin Geissmann, Yang Liu, Lauren Walgren, Sheng Yang He(何胜阳)

主要单位:

1,2加拿大英属哥伦比亚大学(Department of Microbiology and Immunology, The University of British Columbia, Vancouver, British Columbia, Canada;Michael Smith Laboratories, The University of British Columbia, Vancouver, British Columbia, Canada)

动植物所共生的复杂微生物群体(微生物组)通常含有比宿主更多的功能基因和强大的代谢潜能,显著影响宿主的环境适应性。尽管过去几十年的植物免疫学研究系统揭示了植物和病原菌“军备竞赛”的互作机制,但对植物如何富集有益微生物的分子机制却了解极少植物在遭受多种真菌或线虫病害后可以主动在根际土壤中富集有益微生物(荧光假单胞杆菌等)拮抗病害,从而使得土壤成为“抗病土壤”,这被称为植物向益生菌的求救策略(“cry for help”)。尽管“抗病土壤”的现象在上个世纪初就被发现,但植物调控益生菌定殖的分子机制尚不清楚

近日,加拿大英属哥伦比亚大学Cara Haney课题组(第一作者为宋毅博士)在该领域取得突破,在植物学顶级期刊Nature Plants上发表研究论文《FERONIA restricts Pseudomonas in the rhizosphere microbiome via regulation of reactive oxygen species》 (https://dx.doi.org/10.1038/s41477-021-00914-0)。
密歇根州立大学何胜阳课题组(现杜克大学)参与该工作。

该研究从一批能够阻断激素与根系免疫互作的突变体入手[1],通过基于48孔板的高通量植物与根际共生菌互作体系,筛选出*hsm13* 在根际土中显著富集荧光假单胞杆菌(*fluorescent Pseudomonads*)(图0*)。遗传定位和互补实验显示hsm13 表型是由于类受体蛋白激酶FERONIA激酶结构域单碱基突变导致,hsm13 被重命名为fer-8*。

图 0 fer-8 富集假单胞杆菌促进后代植物生长

a,b hsm13 突变体在天然土壤中富集根际荧光假单胞杆菌;

c 微生物组测序表明假单胞杆菌科在fer-8 根际土中显著富集,PL:parental line (野生型亲本系);

d fer-8 塑造的微生物组能够促进后代生长。

通过微生物组测序分析发现,fer-8 突变体显著影响菌群组成。但有趣的是, fer-8 根际微生物组与野生型相比差异十分有限,仅有假单胞杆菌等少数几个科。进一步在48孔板体系中对多个共生菌进行单个接种验证时发现,fer-8 突变体相对特异性的富集绝大多数假单胞杆菌株系,却并不富集其他根际共生菌,例如芽孢杆菌(Bacillus)、草螺菌(Herbaspirillum)和伯克霍尔德氏菌(Burkholderia)等。这说明fer-8 相对特异性的富集荧光假单胞杆菌(多为益生菌),并且没有造成严重的菌群失调(通常是有害的)进一步通过根际微生物组移植实验发现fer-8 塑造的微生物组能够促进下一代植物生长。

图 1 HSM13 / FER 抑制根际假单胞菌的生长

HSM13/FER inhibit rhizosphere Pseudomonas growth

a 在自然土壤中生长时,野生型植物(Col-0和Ws生态型)以及突变体hsm13ark1-1(Col-0背景)以及bri1-5(Ws背景)的形态;

b 在自然土壤中生长时,hsm13具有高水平的与根相关的荧光假单胞菌,而具有类似发育缺陷的其他突变体则不会影响根际荧光假单胞菌的水平。将根际样品制作显微片置于King’s B上,并在紫外线下成像;

c 每克根际样品中荧光菌落的定量(土体土壤样品中n = 3,其他样品中n = 7);

d 本研究中描述的FER蛋白结构域和等位基因的插入/突变位置;

e 3周龄野生型植物(Col-0),亲本系(pCYP71A12:GUS),hsm13fer-4fer-5,F1杂交(fer-4×hsm13Col-0×hsm13 )和fer-4 / FER–GFP 的表型;

f 相对于Col-0,fer-4×hsm13之间的F1杂交具有较高的根际假单胞菌水平,而Col-0×hsm13 F1s恢复的假单胞菌水平与野生型植物相似 (从左到右n=7, 11, 17 and 11);

g 在水培幼苗试验中,Fer-4和fer-5突变体的假单胞菌水平升高。每个点都代表一个实验中六个以上植株的平均值。

c、f、g种采用方差分析(ANOVA)和Tukey’s HSD检验确定差异的统计学显著性。不同字母表示P < 0.05。均值±标准误被显示.

图 2 假单胞菌科在 fer-8 根际微生物群中富集

Pseudomonadaceae are enriched in the rhizosphere microbiome of fer-8

a 实验1中的fer-8 和野生型(Col-0)的土体土壤和根际样品的Bray–Curtis距离的PCoA(基于OTU的相对丰度)统计显著性通过置换多元方差分析检验(土体土壤样品n = 6,其他样品的 n = 8);

b 土体土壤和根际样品中细菌门或纲(变形菌门)的相对丰度。箭头显示相对于亲本系,仅厚壁菌门在 fer-8 的根际中显著富集(3.53倍;使用DESeq2计算);

c 土体土壤和根际样品中的OTU数(左)和香农多样性指数(右)(土体土壤样品中n = 6,其他为8)。统计显著性由ANOVA和Tukey的HSD检验确定(P <0.05)。不同的字母表示P < 0.05;

d fer-8 和野生型亲本系(PL)之间的显著差异丰度门。颜色显示每个科的物种分类信息,点大小表示P < 0.1 的类群的经−log10转换调整后的P值(Padj)

e 在无菌条件下fer-8 和亲本系根际生长的单个细菌菌株的定量研究。通过双尾学生t检验确定每种菌株的fer-8 与亲本系之间比较的统计显著性(P<0.05; P<0.01; P<0.001; NS,不显著)。

数字表示WCS365,WCS358,DC3000,CH409和PAO1的三个独立实验的生物学重复次数以及其他两个独立的实验的生物学重复次数。ce中的箱线图显示了中位数(中心线),第一和第三四分位数(箱线边缘)以及单个数据点。

图 3 Fer-8 微生物组是有益的

The fer-8 microbiome is beneficial

a 亲本系和在自然土壤中(第1代)生长的fer-8,以及野生型Col-0植物(第2代)的代表图像;

b 生长4周后(n=5),在第1代(G1)植物的亲本系和fer-8的根际中定量了荧光假单胞菌;

c 生长在来源于亲本系-或fer- 8 栽培土壤的微生物组移植的土壤上的G2野生型植株的地上部鲜重(n = 15)。

d,e bc中显示实验重复结果(n = 7,定量荧光假单胞菌(d);n = 11和13分别对应于亲本系和fer-8 的地上部鲜重(e));b-e中的统计显著性由双尾t检验确定。

f 第一代亲本系和fer-8植株的平均荧光cfu计数,与在同一土壤中生长的下一代植株的平均地上部鲜重绘制成图。红色虚线表示线性趋势。r是皮尔森相关性。通过双尾t检验确定统计学显著性(t = 5.26;d.f= 2)。每个数据点代表一个独立实验中所有植物的平均值。

图 4 Fer-8 中的假单胞菌富集在很大程度上与茉莉酸信号无关

Pseudomonas enrichment in fer-8 is largely independent of
jasmonic acid signalling

a 从前20个最丰富的GO类别(基于负对数转换的假阳性率)挑选。采用AgriGO进行GO富集分析;

b fer-8 对坏死性病原体灰质芽孢杆菌具有抗性。图像显示接种后3天的病变大小(亲本系和fer-8 分别为n=30和31;两个独立的实验)。数据表示平均值±标准误差。统计显著性由双尾t检验确定(P = 6.08×10-22** P* <0.001);

c Col-0,亲本系,fer-8coi1-16 fer-8coi1-16的生长表型。图像在发芽后3周拍摄;

d 萌发后3周,对不同基因型的地上部鲜重的进行定量(从左到右分别为n = 14、20、20、20和19)。数据来自两个独立的实验;

e fer-8 coi1-16 双重突变体不能恢复fer-8 中的假单胞菌过度生长的表型(n = 10、11、12和10,从左到右)。数据来自三个独立的实验。

对于de,数据显示均值±标准误差。由ANOVA使用Tukey’s HSD 检验确定,不同字母表示P < 0.05。

图 5 FER调节根ROS来控制假单胞菌

FER regulates root ROS to control pseudomonads

a H2DCF-DA染色的亲本根系和用缓冲液或荧光假单胞菌WCS365进行了预处理的fer-8的代表性图像。展示了一个实验的代表性图像,重复两次得到一致的结果;

b 根中定量的平均H2DCF-DA信号强度(两个独立实验);

c 缺乏NADPH氧化酶(rbohD/F)的突变体在土壤中生长时根际荧光假单胞菌数量增加(从左到右分别为n=17、13、17和12;三个或四个独立实验);

d 突变体缺乏作为FER(fls2、efr-1和bak1-5)互作伙伴的免疫受体,不会影响根际假单胞菌水平(n = 7、7、6、7和6,从左至右)。

e 四倍突变体mfec不像fer-8那样改变根际假单胞菌水平(三次独立实验中n = 18)。

f Fer-8ROP2(NADPH氧化酶的正调控因子)的过表达降低了荧光假单胞菌的根际水平(从左到右分别为n=14、19、25、15、13、14、11和11;三至五个独立实验)。

g Col-0,亲本系,fer-8fer-8 ROP2过表达(下划线1-11、5-1和3-1)和ROP2过表达(下划画线8-2和5-1)的根H2DCF染色的相对信号强度值(n=23、17、20、12、7、11、16和9从左到右;2至4个独立实验)。来自不同独立实验的数据被归一化为来自相同实验的Col-0对照的平均值。

h 不同基因型的平均log10[每克根际的荧光cfu],与平均相对H2DCF染色信号强度绘制。红色虚线表示线性趋势。r是皮尔森相关性。通过双尾t检验确定统计学显著性(t = -2.4;d.f = 6)。

b–g中的不同字母表示P < 0.05,基于ANOVA与Tukey’s HSD 检验。

图 6 RALF可提高根际假单胞菌的水平

RALF enriches Pseudomonas levels in the rhizosphere

a 用RALF肽处理可在亲本系中富集根际荧光假单胞菌WCS365-Luc,而在fer-8中则不如此;每个条上方的数字代表每种处理与水处理的对照相比的倍数变化。数据来源于两次独立实验(n = 12)。

b 在自然土壤中,RALF23的过表达显示富集荧光假单胞菌(来自三个独立的实验 n =17)。ab中的统计显著性由双尾t检验确定。数据表示平均值±标准误。

c 基于此和先前的工作,提出了一种依赖FER的荧光假单胞菌的富集模型。真菌和线虫病原体可以分泌类似RALF的肽来劫持FER,并抑制茉莉酸信号传导。FER配体RALF负调控茉莉酸信号转导,提高假单胞菌水平(如箭头所示)。

该研究通过多方面验证,最终揭示FER通过维持根系本底的活性氧自由基(ROS)水平,可以负调控根际益生菌荧光假单胞杆菌定殖。有趣的是,土壤中部分真菌和线虫可以分泌FER的配体肽段RALF类似物[2-4],其中至少线虫分泌的RALF类似物可以“劫持”FER来抑制植物的茉莉酸免疫信号,提升侵染能力。进一步验证表明RALF23肽段处理或者遗传过表达植株都能够富集根际荧光假单胞杆菌,暗示病原菌分泌RALF对FER的攻击会导致根际土壤中荧光假单胞杆菌富集,这可能是植物遭受病害后诱导产生“抗病土壤” 的分子机制之一

引用格式 :Yi Song, Andrew J. Wilson, Xue-Cheng Zhang, David Thoms, Reza Sohrabi, Siyu Song, Quentin Geissmann, Yang Liu, Lauren Walgren, Sheng Yang He & Cara H. Haney. (2021). FERONIA restricts Pseudomonas in the rhizosphere microbiome via regulation of reactive oxygen species. Nature Plants, doi: https://doi.org/10.1038/s41477-021-00914-0

Reference

  1. Zhang, X.C., et al., Jasmonate signalling in Arabidopsis involves SGT1b-HSP70-HSP90 chaperone complexes. Nat Plants, 2015. 1(5):1-8.

  2. Masachis, S., et al., A fungal pathogen secretes plant alkalinizing peptides to increase infection. Nat Microbiol, 2016. 1(6): p. 16043.

  3. Zhang, X., et al., Nematode-Encoded RALF Peptide Mimics Facilitate Parasitism of Plants through the FERONIA Receptor Kinase. Mol Plant, 2020. 13(10): 1434-1454

  4. Thynne, E., et al., Fungal phytopathogens encode functional homologues of plant rapid alkalinization factor (RALF) peptides. Molecular plant pathology, 2017. 18(6): p. 811-824.

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